外泌体提取试剂盒（乳液）

产品描述

外泌体是由细胞分泌的包含RNA和蛋白质的小囊泡(30-150 nm),在血液、唾液、尿液及乳汁等体液中大量存在。外泌体被认为具有细胞间信使的功能,在特定细胞之间传递它们的效应物或信号分子;然而其构造、效应物组成以及所参与的生物学通路目前尚不明晰。

外泌体的生物学功能研究中需要分离完整的外泌体颗粒,而传统超速离心方法步骤繁琐、硬件要求高、操作难度大。宇玫博生物自主开发的外泌体快速提取试剂盒,组分经过优化处理,适用于乳液中的外泌体提取,可快速高效地获得高纯度外泌体颗粒,可用于电镜分析、NTA粒径分析、核酸分析、蛋白分析、细胞学实验和动物实验等。

自备材料

高速离心机(可达到10000 g离心力),涡旋振荡器;50mL离心转子, 50mL离心管,2mL离心转子,1.5mL离心管,PBS缓冲液。

产品组成

实验流程

操作规程

一、样品预处理

1,取样:如果是冻存样品,从冰箱取出后于25℃水浴中进行解冻,将完全融化后的样品置于冰上;如果是新鲜样品,收集样品后置于冰上;

2,样品初始用量:(单次提取时的样品量)

样品名称:单次最佳处理体积

乳液:50 mL

3,离心去脂:将样品转移至离心管中,于4℃以10000 g离心20 min,去除样品中的脂质及部分蛋白;(注:离心后样品分为三层,上层为脂质层,下层为蛋白沉淀,中间层为乳清。离心后上层状态为“致密、稳定、不易脱落”,若上层“松软、易脱落”且下层沉淀较多,可继续重复此步骤,每次离心取中间层液体)

4,乳清转移:将去除脂质的乳清(中间层液体)转移至新的50mL离心管中;(注:可用枪头将上层脂质戳破后缓慢倾倒,或用移液器转移,转移后的乳清中带有少量脂质和沉淀是正常现象,不影响后续实验。)

二、去除杂蛋白

1,乳清澄清:乳清中加入Solution A,将离心管颠倒混匀至呈现“半透明状”,再加入Solution B,颠倒混匀后于2℃至8℃静置10min;(注:静置完成后轻轻晃动离心管,呈现 “豆花状“固体,液体部分为”透明状“。若未呈现“豆花状”或样品仍为”乳白色“,可再适当加入Solution B至液体为”透明状“。)

乳清体积Solution A剂量Solution B剂量

40 mL4 mL3 mL

注:具体加入剂量请根据上表等比例换算

2,离心去蛋白:将澄清后的乳清于4℃以10000 g离心10 min,收集上清液;

3,上清液过滤:将收集的上清液转移至50 mL离心过滤柱中,于4℃以3000 g离心2 min;(注:若未过滤完全,可重复此步骤。50mL离心过滤柱为一次性耗材,不建议重复使用。)

4、将过滤后的上清液转移至新离心管中,加入Solution C后颠倒混匀;(注:Solution C加入剂量和Solution B剂量保持一致)

离心过滤后样本体积:40 mL

Solution C剂量:3 mL

三、提取外泌体

1,上清液预处理:在加入Solution C后的上清液中加入Solution D,具体加入剂量如下:

离心过滤后样本体积:40 mL

Solution D剂量:10 mL

   注:其他剂量请根据表中的试剂用量等比例换算

2,溶液混合:加入Solution D后将离心管盖紧,通过涡旋振荡器混匀1 min,再放置于2℃至8℃静置至少2 h;(注:增加静置时间可提高外泌体得率,但静置时间不可超过24h)

3,沉淀外泌体:取出装有混合液的离心管于4℃以10000 g离心60 min,弃上清,沉淀中富含外泌体颗粒;(注:尽可能吸净上清液)

4,外泌体重悬:取1×PBS均匀吹打离心沉淀物(具体加入剂量如下表),待其溶解后,将重悬液转移至新的1.5 mL离心管中;

样品体积:40 mL

加入PBS剂量:1 mL

注:其他剂量请根据表中的试剂用量等比例换算

5,收获外泌体颗粒:将含有重悬液的1.5 mL离心管于4℃以12000 g离心5 min,保留上清液,该上清液中富含外泌体颗粒。(注:若沉淀较多,可重复该步骤多次至无明显沉淀,每次取离心上清液。外泌体溶液可能带有淡淡的乳白色,此为正常现象)

6,外泌体的保存:纯化后的外泌体以50-100 μL进行分装保存于-80℃低温冰箱中,以备后继实验使用。

四、储存条件

本品在室温条件下可稳定保存24个月,使用前请充分混匀。

五、注意

本产品仅用于生命科学研究,不得用于医学诊断及其他用途!

六、其它事项

更多技术问题,请联系宇玫博为您作进一步解答。

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